Reverzni inženiring izvorne kode cepiva BioNTech/Pfizer proti SARS-CoV-2

Translations: ελληνικά / عربى / 中文 (Weixin video, Youtube video) / 粵文 / bahasa Indonesia / český / Català / český / Deutsch / English / Español / 2فارسی / فارسی / Français / עִברִית / Hrvatski / Italiano / Nederlands / 日本語 / 日本語 2 / नेपाली / Polskie / русский / Português / Română / Slovensky / Türk / український / Markdown for translating

Pozdravljeni! V tem članku bomo črko po črko pregledali izvorno kodo cepiva BioNTech/Pfizer SARS-CoV-2 mRNA.

Želim se zahvaliti vsem, ki so si vzeli čas in pregledali ta članek in preverili pravilnost ter izboljšali berljivost. Za vse napake sem kriv sam, če kakšno najdete, jo prosim sporočite na bert@hubertnet.nl ali @bert_hu_bert

Cepivo je tekočina, ki jo injiciramo v roko, kako lahko torej govorimo o njegovi izvorni?

To je dobro vprašanje. Da si lahko bolje predstavljamo o čem govorimo, začnimo z delčkom izvorne kode cepiva BioNTech/Pfizer, zananega tudi kot BNT162b2 ali Tozinameran also known as Comirnaty.

Digitalna koda je bistvo BNT162b2 mRNK cepiva. Sestavljena je iz 4284 znakov, kar pomeni da je lahko stlačimo v malo več kot 10 tvitov. Na začetku postopka priprave cepiva, nekdo pošlje to kodo na DNK tiskalnik (da DNK tiskalnik!), ki spremeni digitalne bite na disku v prave DNK molekule.

Iz tega tiskalnika pridobimo majhne količine DNK, ki skozi veliko bioloških in kemijskih procesov spremenijo v RNK (več o RNK kasneje), ki konča v steklenički s cepivom. 30 miligramska doza vsebuje 30 miligramov molekul RNK. Poleg tega, je mRNK zapakirana v pametno lipidno membrano, ki jo dostavi v naše celice.

RNK je verzija DNK, ki ustreza ‘delovnemu spominu’. DNK je biološka oblika ‘flash’ računalniškega spomina. DNK je zelo stabilna, ima veliko redundance in je izredno zanesljiva. Podobno kot v računalništvu, se koda ne izvaja direktno iz flash spomina (DNK), ampak se najprej skopira na hitrejši, bolj vsestranski, a krhkejši sistem.

V računalništvu je to RAM, v biologiji pa RNK. Podobnost je osupljiva. V nasprotju s flash spominom, so podatki v RAM-u zelo neobstojni, če ne skrbimo za njih. mRNK Pfizer/BioNTech cepivo moramo shranjevati v zamrzovalnikih iz istega razloga.

Vsaka črka v molekuli RNK tehta pribljžno 0.53·10⁻²¹ gramov, kar pomeni da je v vsaki 30 mikogramski dozi cepiva 6·10¹⁶ RNK črk. To je približno 25 petabajtov, kar ustreza 2000 milijard kopijam 4284 znakov, ki sestavljajo izvorno kodo cepiva. Dejanskih podatkov je v cepivu zgolj malo več kot en kilobajt. Celoten virus SARS-CoV-2 vsebuje 7.5 kilobajtov podatkov.

Kratek uvod

DNK je digitalna koda. Za razliko od računalnikov, kjer uporabljamo 0 in 1, življenje uporablja A, C, G in U/T (nukleotide oziroma baze).

V računalnikih shranjujemo 0 in 1 v obliki naboja, električnega toka, magnetnega dipola, napetosti, modulacije signala, ali kot spremembe v reflektivnosti. Torej, 0 in 1 nista neka abstraktna koncepta, ampak živita v obliki elektronov in drugih fizičnih oblikah.

V naravi so A, C, G in U/T baze shranjene v verigah, ki sestavljajo DNK (ali RNK) molekule.

V računalništvu, 8 bitov predstavlja en bajt, ki je tipična podatkovna enota.

Narava združuje 3 nukleotide v en kodon, to je tipična enota v biologiji. Kodon vsebuje 6 bitov informacije (2 bita na en DNK znak, 3 znaki = 6 bitov. Kar omogoča 2⁶ = 64 različnih kodonov.)

Vse to izgleda do sedaj zelo digitalno. Če ste v dvomih, poglejte WHO document in se preglejte digitalno kodo z lastnimi očmi.

Nadaljno branje je na voljo tukaj - tale povezava (‘What is life’) vam bo v pomoč pri razumevenju nadaljnega besedila. V obliki videa jo najdete tukaj.

Torej, kaj pravzaprav ta izvorna koda naredi?

Ideja cepiva je, da nauči imunski sistem, kako se obvarovati pred patogenom, tako da oseba ne zboli. Navadno to storimo z vbrizganjem oslabljenega virusa. Z dodatkom ‘adjuvanta’ poženemo imunski sistem v akcijo. Oslabitev virusa ponavadi zahteva na milijone jajc (ali insektov). Pri tem postopku je potrebno tudi veliko sreče in zahteva precej časa. Včasih lahko uporabimo tudi drug (nesoroden) virus za vzpodbuditev imunskega sistema.

Cepivo na osnovi mRNK doseže enak cilj (’natrenira naš imunski sistem’), ampak z lasersko natančnostjo.

Cepivo vsebuje genetski material, ki vsebuje načrt za slavni ‘spike’ protein virusa SARS-CoV-2. S pomočjo premetenih kemijskih trikov, cepivo vnese ta genetski material v nekatere naše celice.

Te celice potem začnejo proizvajati SARS-CoV-2 ‘spike’ protein, kar požene naš imunski sistem v akcijo. Produkcija spike proteinov in (pomebno) znaki, da je nekaj prevzelo nadzor nad našimi celicami, sprožijo močan imunski odziv na ‘spike’ protein IN njegov proces proizvodnje.

In to nas pripelje do 95% učinkovitega cepiva.

Izvorna koda!

Začnimo na začetku, kar je zelo dobro mesto za začetek. WHO-jev dokument vsebuje tole pomebno sliko:

To je na nek način kazalo. Začnimo s ‘cap’, k je naslikan kot majhna kapa.

Podobno kot na računalniku, ne morete preprosto vstaviti ‘opcode’ v datoteko in jo zagnati, tudi biološki operacijski sistem potrebuje ‘header-je’, ’linker-je’ in konvencije klicanja ukazov.

Koda cepiva se začne z nukleotidoma:

GA

To lahko primerjamo z DOS in Windows izvršnimi datotekami, ki se začnejo z MZ, ali UNIX skriptami, ki se začnejo z #!.

V obeh primerih, na računalniku in v celici, se ti dve prvi črki ne izvedeta (zaženeta), vendar če ju ni, potem se tudi nadaljnja koda ne izvede.

Kapa mRNK molekule ima več funkcij. Na primer, ta kapa označuje, da naša koda prihaja iz jedra celice. V našem primeru to ni res, ker koda prihaja iz cepiva, vendar na ta način prelisičimo celico. Kapa daje legitimnost naši kodi, kar jo zaščiti pred uničenjem.

Prva dva nukleotida GA sta kemijsko malce drugačna od preostale RNK. V tem smislu GA omogoči zunajpasovno signalizacijo.

5’ nekodirajoča regija (5’ UTR)

RNK molekule se lahko berejo zgolj v eno smer. Del kjer se branje začne se imenuje 5’ ali ‘five-prime’. Branje se konča na 3’ mestu (’three-prime’).

Življenje je osnovano na proteinih (in molekulah narejenih s pomočjo proteinov). Recept za te proteine je shranjen v RNK. Prepis RNK v proteine se imenuje translacija.

Spodaj je prikazana 5’ nekodirajoča regija (‘UTR’), ta del ni del proteina:

GAAΨAAACΨAGΨAΨΨCΨΨCΨGGΨCCCCACAGACΨCAGAGAGAACCCGCCACC

Tu nas čaka prvo presenečenje. Normalna RNK vsebuje baze A, C, G in U. U ustreza ‘T’ v DNK. Ampak zgoraj vidimo Ψ, zakaj?

To je eden od premetenih delov cepiva. Naše telo uporablja zelo dober antivirusni sistem. Naše celice so zelo pozorne na tuje RNK molekule in jih poskušajo uničiti preden se te uspejo prepisati v proteine

To je problematično za naše cepivo, ki se mora izmakniti temu obrambnemu sistemu. Raziskovalci so z dolgoletnim eksperimentiranjem ugotovili, da menjava U v RNK z nekoliko spremenjeno molekulo, pretenta naš imunski sistem.

V BioNTech/Pfizer cepivu je tako vsak U zamenjan z 1-metil-3’-pseudouridilil-om, ki ga označujemo s Ψ. Resnično premetena ideja se skriva v tem, da čeprav ta zamenjava pomiri imunski sistem, celica še vedno prebere ta del kot U.

Tudi v računalništvu poznamo ta trik - včasih je mogoče poslati rahlo spremenjeno različico sporočila, ki zmede požarni zid in varnostne rešitve, vendar ga strežniki še vedno sprejmejo - kar lahko omogoči vdor v strežnik.

Sedaj pobiramo sadove fundamentalnih raziskav opravljenih v preteklosti. Raziskovalci, ki so odkrili ta trik s Ψ, so se najprej morali boriti za financiranje njihovega dela in kasneje za objavo v znanstvenih člankih. Sedaj smo jim vsi lahko hvaležni in prepričan sem, da jih čakajo Nobelove nagrade.

Veliko ljudi zanima, ali lahko tudi pravi virus uporabi to Ψ tehniko in prelisiči naš imunski sistem? Na kratko, to je zelo malo verjetno. Narava nima mehanizmov, da sintetizira 1-metil-3’-pseudouridilil nukleotide. Virusi uporabljajo mehanizme celic za njihovo razmnoževanje in ta opcija v celicah enostavno ne obstaja. mRNK iz cepiva se hitro razgradi v človeškem telesu, in ni možnosti, da bi se Ψ-modificirana RNK začela podvojevati. Za več informacij preberite “No, Really, mRNA Vaccines Are Not Going To Affect Your DNA”

Dobro, pojdimo nazaj na 5’ nekodirajočo regijo. Kakšno funkcijo ima zaporedje teh 51 črk? Kot večina stvari v naravi, ima tudi to zaporedje več funkcij.

Naše celice prevajajo RNK v proteine z posebnim molekulskim ustrojem - ribosom-om. Ribosom deluje kot 3D tiskalnik za proteine, ki sprejme navodila v obliki RNK in sintetizira zaporedje aminokislin. To zaporedje se nato zvije v protein.

Source: [Wikipedia user Bensaccount](https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Protein_translation.gif)

Ta proces je prikazan zgoraj. Črn trak spodaj je RNK. Trak, ki nastaja v zelenem delu je nastajajoč protein. Stvari, ki prihajajo in odhajajo iz ribosoma so aminokisline z nastavki, slednji omogočajo prileganje v RNK. Ribosom se mora pripeti na RNK, da jo lahko začne brati. Lahko si predstavljate, da ribosom ne more začeti branja kar nekje na sredini RNK. 5’ UTR tako predstavlja mesto, kjer se branje začne (’landing zone’).

Poleg tega, UTR vsebuje tudi meta-podatke: kdaj naj se prepis zgodi? In koliko naj se prepiše? Za cepivo so uporabili UTR, ki naroči ribosomu naj s prepisovanjem začne takoj. Ta UTR je osnovan na osnovi gena za alfa globin. Znano je, da ta gen robustno proizvede veliko proteinov. V zadnjih letih, so znanstveniki dodatno optimizirali ta UTR (kot je opisano v WHO dokumentu), tako da uporabljen UTR ne ustreza čisto alfa globinovemu, ampak izboljšani različici.

Signalni peptid glikoproteina S

Cilj cepiva je vzpodbuditi celico, da začne proizvajati kopije ‘spike’ proteina virusa SARS-CoV-2. Do sedaj smo v izvorni kodi srečali predvsem metapodatke. Sedaj pa gremo proti dejanski kodi za virusni protein.

Prebiti se moramo še skozi zadnji sloj metapodatkov. Ko ribosom (iz zgornje animacije) zgradi protein, mora ta protein dobiti navodila, kam oditi. Ta navodila so zapisana v zaporedju za signalni peptid glikoproteina S (razširjena vodilna sekvenca).

Na začetku proteina je neke vrste etiketa za naslov, kamor mora ta protein oditi. V našem primeru signalni peptid pravi, da mora protein oditi iz celice skozi endoplazemski retikulum.

Signalni peptid je precej kratek, vendar ko pogledamo zaporedje, ki ga kodira, opazimo razlike med virusno RNK in RNK v cepivu:

(Za lažjo primerjavo sem zamenjal modificiran Ψ nazaj v navadni RNK U)

           3   3   3   3   3   3   3   3   3   3   3   3   3   3   3   3
Virus:   AUG UUU GUU UUU CUU GUU UUA UUG CCA CUA GUC UCU AGU CAG UGU GUU
Cepivo:  AUG UUC GUG UUC CUG GUG CUG CUG CCU CUG GUG UCC AGC CAG UGU GUU
               !   !   !   !   ! ! ! !     !   !   !   !   !            

Kaj se torej dogaja? Ni naključje, da sem zapisal RNK zaporedje v skupkih treh črk. Tri črke namreč predstavljajo kodon. Vsak kodon predstavlja kodo za eno aminokislino. Signalni peptid v cepivu je sestavljen iz natančno enakih aminokislin kot v virusu samem.

Zakaj potem obstajajo razlike v RNK?

Obstaja 4³=64 različnih kodonov, ker imamo 4 različne črke in tri črke predstavljajo en kodon. Ampak v naravi imamo zgolj 20 različnih aminokislin. To pomeni, da več različnih kodonov predstavlja enako aminokislino.

Življenje uporablja praktično univerzalno tabelo za pretvorbo RNK kodonov v aminokisline:

V tej tabeli lahko opazimo, da so vse spremembe v cepivu sinonimi (UUU -> UUC). RNK v cepivu je drugačna, ampak aminokislinsko zaporedje, ki ga RNK kodira je enako kot v virusu.

Če pogledamo podrobneje, opazimo, da je večina sprememb v tretji črki kodona, označeni s ‘3’ zgoraj. Iz zgornje tabele je razvidno, da je črka na mestu ‘3’ ponavadi nepomembna za večino aminokislin.

Če te spremembe v RNK vodijo do sinonimov, zakaj so potem sploh prisotne? Podroben pregled zaporedja nam razkrije, da vse spremembe, razen ene, pomenijo več C-jev kot G-jev v mutanti.

Vendar zakaj bi to storili? Kot opisano zgoraj, je naš imunski sistem zelo pozoren na ’eksogeno’ RNK, ki prihaja od zunaj. Da se bi izognili odkritju, smo ‘U’ že zamenjali s Ψ.

Izkaže se, da telo RNK z večjo vsebnostjo G-jev in C-jev z večjo učinkovitostjo pretvori v proteine.

V cepivu so tako, na mestih kjer je to mogoče, zamenjali ostale črke z G-ji in C-ji.

Zame je zanimivo to, da v enem primeru te zamenjave niso naredili. Specifično v primeru CCA -> CCU. Če kdo slučajno pozna razlog za to, naj mi ga prosim sporoči! Zavedam, se da so nekateri kodoni bolj običajni v človeškem genomu kot nekateri drugi, ampak prebral sem tudi, da to ne vpliva preveč na hitrost translacije.

Spike protein

Naslednji 3777 črk v RNK cepiva je podobno optimiziranih z dodatkom veliko C-jev in G-jev. Ker tu ni prostora, ne bom zapisal celotnega zaporedja, ampak se bomo osredotočili zgolj na en izjemno poseben del. To je del zaradi katerega cepivo deluje in nam bo omogočil vrnitev življenja v normalo:

                  *   *
          L   D   K   V   E   A   E   V   Q   I   D   R   L   I   T   G
Virus:   CUU GAC AAA GUU GAG GCU GAA GUG CAA AUU GAU AGG UUG AUC ACA GGC
Cepivo:  CUG GAC CCU CCU GAG GCC GAG GUG CAG AUC GAC AGA CUG AUC ACA GGC
          L   D   P   P   E   A   E   V   Q   I   D   R   L   I   T   G
           !     !!! !!        !   !       !   !   !   ! !              

Tu lahko opazimo običajne sinonimne RNK spremembe. Na primer, v prvem kodonu vidimo, da je bil CUU zamenjan v CUG. To doda en G v zaporedje cepiva, ki pomaga povečati proizvodnjo proteinov. Vendar oba kodona CCU in CUG kodirata isto aminokislino ‘L’ ali leucin, tako, da ne pride do spremembe aminokislinskega zaporedja.

Če pogledamo celoten spike protein v cepivu, so vse spremembe sinonimne … razen dveh. Ti dve posebni spremembi vidimo v prikazanem delu.

Tretji in četrti kodon zgoraj predstavljata ti spremembi. Aminokislini K in V sta zamenjani s P ali prolinom. Za ‘K’ smo potrebovali tri spremembe (’!!!’), za ‘V’ pa zgolj dve (’!!’).

Izkaže se, da ti dve spremembi močno povečata učinkovitost cepiva.

Zakaj? Virusni delec SARS-CoV-2 ima na površini veliko spike proteinov:

Spike-i (roglji, bodice) so pritrjene na ’telo’ virusa (‘virusna kapsida’). Problem je v tem, da imamo v našem cepivu zgolj spike in ne celotnega virusa.

Nespremenjeni spike, se brez pritrditve na kapsido ne zvije v pravo obliko. Če bi takšno cepivo injicirali v naše telo, bi razvili imunost za nepravo obliko spike proteina.

Ker je takšna struktura spike proteina preveč različna od tiste, ki je pritrjena na virus, cepivo v tem primeru ne bi delovalo dobro.

Kaj lahko storimo? V letu 2017 so znanstveniki opazili, da če vnesejo dvojno prolinsko substitucijo v SARS-CoV-1 in MERS spike protein, se ta zvije v pravo konformacijo, takšno, ki je prisotna v virusu samem. To deluje, ker je prolin zelo rigidna aminokislina in deluje kot nekakšna opornica, ki stabilizira protein v strukturo, ki jo potrebujemo za dober imunski odziv.

Raziskovalci, ki so odkrili to zamenjavo, bi morali hoditi na okoli in si deliti petke. Iz njih bi morala sijati ogromna količina ponosa. In vse to bi bilo zelo zasluženo.

Nova novica! Kontaktirali so me iz McLellan-ovega laboratorija, to je ena izmed skupin, ki je odkrila prolinsko zamenjavo. Povedali so mi, da je deljenje petk zaenkrat prestavljeno zaradi pandemije in da so veseli, da so njihovi rezultati pripomogli razvoju cepiva. Poudarili so tudi, da so k odkritju prispevale druge skupine in raziskovalci.

Konec proteina, naslednji koraki

Tudi na koncu izvorne kode spike proteina najdemo nekaj sprememb:

          V   L   K   G   V   K   L   H   Y   T   s             
Virus:   GUG CUC AAA GGA GUC AAA UUA CAU UAC ACA UAA
Cepivo:  GUG CUG AAG GGC GUG AAA CUG CAC UAC ACA UGA UGA 
          V   L   K   G   V   K   L   H   Y   T   s   s          
               !   !   !   !     ! !   !          ! 

Na koncu proteina najdemo ‘stop’ kodon, tukaj je označen z malim ’s’. To je oznaka, da je protein tukaj konča. Originalni virus uporablja stop kodon UAA, v cepivu pa najdemo dva UGA stop kodona, verjetno za vsak slučaj.

3’ nekodirajoča regija

Na podoben način kot ribosom potrebuje 5’ regijo za začetek, na koncu potrebuje 3’ regijo, da ve kje končati.

Veliko bi lahko napisal o 3’ UTR regiji, ampak bom na tem mestu samo citiral Wikipedijo: “3’ nekodirajoča regija igra ključno vlogo v izražanju genov. Izražanje kontrolira preko vpliva na lokalizacijo, stabilnost in učinkovitost translacije mRNK … Kljub našemu trenutnemu razumevanju 3’ UTR, je še vedno veliko neznanega”.

Vemo, da nekatere 3’ UTR regije zelo uspešno pospešujejo izražanje proteinov. Kot je zapisano v dokumentu WHO, je bila 3’ UTR regija, ki je uporabljena v cepivu BioNTech/Pfizer, izbrana iz “amino-terminalnga ojačevalec razcepa (AES) mRNK in mitohondrijsko kodirano 12S ribosomsko RNK, ki daje RNK stabilnost in omogoča visoko izražanje proteinov”. Kar lahko k temo dodam je samo, bravo!

Konec vsegAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

Konec mRNK je poliadeniliran. Ali povedano bolj enostavno, mRNK se koča z veliko zaporednih AAAAAAAAAAAAAAAAAAA. Celo mRNK je dovolj leta 2020!

mRNK molekula je lahko uporabljena večkrat, vendar z vsako uporabo izgubi nekaj A-jev na koncu. Ko A-jev na koncu zmanjka, mRNK izgubi funkcionalnost. Tako, da ‘poli-A’ rep predstavlja zaščito pred razgradnjo.

Raziskave so pokazale, da je optimalno število A-jev na koncu mRNK cepiva nekje okoli 120.

Cepivo BNT162b2 se konča z:

                                     ****** ****
UAGCAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAGCAUAU GACUAAAAAA AAAAAAAAAA 
AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAA

To je 30 A-jev, potem nukleotidni linker (GCAUAUGACU), ki mu sledi še 70 A-jev.

Sumim, da gre tukaj za dodatno optimizacijo, ki izboljša izražanje proteina.

Povzetek

Spoznali smo mRNK zaporedje cepiva BNT162b2 in naučili smo se, čemu so posamezni deli zaporedja namenjeni:

• Kapa ‘cap’ zagotovi, da RNK izgleda kot normalna mRNK molekula
• Optimizirana 5’ nekodirajoča regija (UTR) poskrbi za boljšo sintezo proteina
• Optimizirano zaporedje za signalni peptid, ki določa kam bo protein šel (100% kopija originalnega virusa)
• Optimizirano zaporedje za spike protein, z dvema ‘prolinskima’ zamenjavama, ki poskrbita, da ima protein pravo obliko
• Optimizirana 3’ nekodirajoča regija (UTR) poskrbi za boljše izražanje proteina
• Nekoliko skrivnostni poly-A rep z nepojasnjenim ’linker-jem’ je pomemben za stabilnost mRNK

Optimizacija kodonov doda tudi precej G in C v mRNK zaporedje. Uporaba Ψ (1-metil-3’-pseudouridilil) namesto U pretenta imunski sistem, da ta ne uniči mRNK. mRNK tako nauči naš imunski sistem, da se lahko uspešno bori proti pravemu virusu.

Nadaljnje branje/viri

V letu 2017 sem imel dvourno predstavitev o DNK, ki jo lahko pogledate tukaj. Tako kot ta članek, je tudi predstavitev namenjena računalničarjem.

Od leta 2001 upravljam spletno stran DNK za programerje.

Všeč vam bo mogoče tudi ta uvod v naš neverjeten imunski sistem.

Tudi na mojem blogu lahko najdete veliko informacij o DNK, SARS-CoV-2 in COVID-u.